Mit der Entdeckung des Enzyms Reverse Transkriptase (RT) vor mehr als 25 Jahren konnte erstmals ein Test entwickelt werden, der alle infektiösen Retroviruspartikel erfasst. In der Zwischenzeit haben ForscherInnen des Nationalen Zentrums für Retroviren in Zürich dieses Testverfahren verfeinert und eine Methode ausgearbeitet, die sich Strukturmerkmale aller Retroviren zu Nutze macht und helfen kann, auch die Entstehung anderer Krankheiten als der HIV-Infektion zu verstehen.
Von Jürg Böni und Jörg Schüpbach
Mit der Verbreitung der menschlichen Immunschwäche Aids sind Retroviren zum ersten Mal von einer breiten Öffentlichkeit als Infektionserreger wahrgenommen worden. Retroviren haben aber schon in der Vergangenheit in verschiedenen Bereichen eine wichtige Bedeutung erlangt.
Die Anfänge der Retrovirusforschung gehen auf die erste Dekade dieses Jahrhunderts zurück, in der es gelang, Blutkrebs und gewisse andere bösartige Tumoren von Hühnern mit einem zellfreien Extrakt auf gesunde Tiere zu übertragen. Ausser diesen ehemals weit verbreiteten Hühnertumoren gibt es mit der Leukämie der Katze (siehe Artikel »Das Immunschwächevirus der Katze«) und der infektiösen Gelenksentzündung der Ziege zwei weitere veterinärmedizinisch relevante Krankheiten in der Schweiz, die durch Retroviren verursacht werden.
In den Siebzigerjahren geriet die Impfstoffherstellung in die Schlagzeilen, nachdem man entdeckt hatte, dass Gelbfieberimpfstoffe, die auf Hühnerembryonen hergestellt wurden, häufig Hühnertumorviren enthielten. Eine Übertragung dieser Viren auf den Menschen konnte nie nachgewiesen werden. Aus Gründen der Produktesicherheit wurden aber die Vorschriften zur Herstellung von Impfstoffen und anderen biologischen Produkten überarbeitet. Schliesslich sind Retroviren durch die Aids-Epidemie und in jüngster Zeit auch im Zusammenhang mit der Xenotransplantation im Gespräch geblieben. Letzteres verdanken sie einer Besonderheit ihres Vermehrungszyklus.
Endogene Retroviren
Infektiöse Retroviruspartikel enthalten als Virusgenom zwei identische Kopien einer einzelsträngigen RNS. Wird eine Zelle infiziert, so wird von der freigesetzten Virus-RNS mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase (RT), welches im Viruspartikel enthalten ist, in einem komplexen Vorgang eine doppelsträngige DNS-Kopie hergestellt und in die DNS der Wirtszelle eingebaut (Abb. 1). Diese Form des Virus wird als Provirus bezeichnet. Das Provirus ist nun ein Teil des Wirtsgenoms und bleibt während der gesamten Lebensdauer dieser Zelle und deren Nachkommen erhalten. Wird eine Zelle der Keimbahn infiziert, kann ein solches Provirus auf die nächste Generation übertragen werden. Dieses ist dann in jeder Zelle dieses Organismus vorhanden. Solche Viren werden als endogene Retroviren bezeichnet. Endogene Retroviren sind weit verbreitet und sie sind auch ein Bestandteil des menschlichen Genoms.
Bis heute ist kein menschliches endogenes Retrovirus bekannt, das eine Krankheit verursacht. Die Mehrzahl der endogenen Retroviren sind auf Keimbahninfektionen zurückzuführen, die vor Hunderttausenden bis Millionen von Jahren stattgefunden haben. Sie sind meistens stark degeneriert und können keine Partikel mehr bilden. Es gibt jedoch auch einige endogene Retroviren, die vollständige, infektiöse Partikel ausbilden können. In der Regel sind diese für die Individuen der gleichen Art nicht infektiös. Sie können sich aber oft in Zellen anderer Tierarten oder auch des Menschen vermehren. Im Falle einer Xenotransplantation von Zellen oder Organen könnten deshalb endogene Retroviren der Spenderart auf den Empfänger übertragen werden. Bei den Schweinen wurde vor kurzem tatsächlich ein endogenes Retrovirus gefunden, das sich in menschlichen Zellen vermehren kann, was nun intensive Abklärungen zur Folge hat.
Erste Nachweisverfahren
Zum Nachweis und zur Identifizierung von Retroviren werden heute meistens hochempfindliche Verfahren eingesetzt, die einen einzelnen Virustyp erfassen (siehe Artikel »Blutspenden ohne Risiko«). Wie zur Anfangszeit der Retrovirusforschung benötigen wir jedoch auch heute noch Verfahren, die es erlauben, ein Retrovirus nachzuweisen und zu charakterisieren, ohne dass Kenntnisse über seine genetische Verwandtschaft vorliegen müssen. So wird zum Beispiel vermutet, dass weitere menschliche und tierische Erkrankungen existieren, die durch bisher unbekannte Retroviren verursacht werden.
Die Elektronenmikroskopie bot zum ersten Mal die Möglichkeit, Retroviren morphologisch darzustellen und sie als Gruppe zusammenzufassen. Mit Untersuchungsmaterial aus kranken Tieren konnten mit diesem Ins-trument aber nur wenige Retrovirusinfektionen nachgewiesen werden, weil dafür grosse Virusmengen notwendig sind.
Ein grosser Fortschritt wurde vor etwas weniger als dreissig Jahren erzielt, als in den freien Viruspartikeln das Enzym Reverse Transkriptase entdeckt wurde. Weil dieses Enzym eine Voraussetzung für eine erfolgreiche Infektion ist (siehe Abb. 1), muss es von all den verschiedenen Retroviren in ihren Viruspartikeln mitgeführt werden. Da dieses neuentdeckte Enzym zudem nur bei den Retroviren vorkam, wurde ein Test entwickelt, der alle Retroviren nachweisen konnte: der Reverse-Transkriptase-Test, abgekürzt RT-Test.
In der Folge beruhte die Identifizierung von unbekannten Retroviren auf dem Einsatz von Zellkulturen, in denen die Viren passagiert und zu hohen Mengen vermehrt werden konnten, dem Nachweis von RT-Aktivität in der Kultur sowie dem mikroskopischen Nachweis von Retroviruspartikeln. Aus den Viruspartikeln oder den infizierten Zellen konnte dann mit Hilfe gentechnischer Methoden die Virusnukleinsäure kloniert werden. Mit dieser Strategie gelang es beispielsweise, den Verursacher der menschlichen Immunschwäche Aids, das HI-Virus, nachzuweisen und zu charakterisieren.
Die Geschichte der Entdeckung des HI-Virus hat gleichzeitig aber auch die Limiten dieser Strategie offenbart. Der RT-Test leidet unter einer schlechten Spezifität und ist gleichzeitig relativ unempfindlich, das heisst, er benötigt mehr als hunderttausend Viruspartikel, bevor er positiv ausfällt. Da für den direkten Nachweis von RT die Viruskonzentration im Blut von Aids-PatientInnen zu gering war, musste das Virus zuerst in einem Zellkultursystem vermehrt werden. Die Identifizierung eines geeigneten Zellkultursystems erfolgt jedoch nach dem Prinzip von Versuch und Irrtum, weshalb Misserfolg und Frustration über den Erfolg dominieren.
Neue Strategien
Mit der Erfindung der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) wurde es möglich, geringste Mengen von DNA sequenzspezifisch zu vermehren und anschliessend nachzuweisen. Am Nationalen Zentrum für Retroviren haben wir diese neue Möglichkeit als Anlass genommen, die Strategie zum Nachweis und der Charakterisierung von unbekannten Retroviren zu überdenken und zu verbessern.
Unsere Strategie beinhaltet drei Phasen. Zuerst wird ein Retrovirus mit einem verbesserten RT-Test in einem Untersuchungsmaterial nachgewiesen. Von den darin enthaltenen Viruspartikeln wird anschliessend die Sequenz des 5’-Endes der Virus-RNS gewonnen. Schliesslich wird mit Hilfe der PCR das gesamte Virusgenom vermehrt und sequenziert.
Der Nachweis von RT-Aktivität im Reagenzglas beruht auf der RNS-abhängigen Synthese eines DNS-Stranges. Durch zwei Massnahmen gelang uns eine dramatische Verbesserung des RT-Tests (Abb. 2). Der neue Test, den wir Product-Enhanced RT-Test (PERT-Test) getauft haben, verfügt über eine etwa 1 Million mal höhere Empfindlichkeit als das frühere Verfahren. Die Nachweisgrenze liegt bei weniger als zehn Viruspartikeln. Somit ist es jetzt möglich, HI-Virus ohne eine vorgängige Anreicherung in der Zellkultur direkt im Blut von infizierten PatientInnen nachzuweisen. Gleichzeitig ist der Test jedoch auch spezifischer geworden, das heisst, es gibt weniger falsch positive Befunde als mit dem klassischen Test.
Die Grundlage für die Identifizierung und Charakterisierung eines Retrovirus ist die Basensequenz des viralen Genoms. Um ohne Kenntnisse der genetischen Verwandtschaft von der Virus-RNS eine Sequenz zu erhalten, haben wir eine Methode entwickelt, die sich gewisse Strukturmerkmale aller Retroviren zu Nutze macht.
Als erstes wird die Sequenz
des 5’-Endes der Virus-RNS bestimmt. Die dafür wesentlichen Strukturmerkmale sind zusammen mit den im Reagenzglas durchgeführten Enzymreaktionen in Abbildung 3 dargestellt. Die gewonnene Sequenz enthält eine mit «R» bezeichnete Teilsequenz, welche am entgegengesetzten Ende der Virus-RNS, unmittelbar vor dem «A»-Schwanz, der nicht für das Virus spezifisch ist, wiederholt ist (Abb. 3). Mit Hilfe der PCR kann man deshalb bestätigen, dass sich dieses Ende tatsächlich im Untersuchungsmaterial befindet und somit einen möglichen Artefakt ausschliessen. Schliesslich lässt sich mit Hilfe von zwei Initiatoren, sogenannten Primern, welche für die «R»-Sequenzen in den beiden Enden spezifisch sind, fast das gesamte Virusgenom im Reagenzglas vermehren und anschliessend sequenzieren.
Der Erfolg dieser Strategie soll hier kurz am Beispiel einer Zusammenarbeit mit Bernard Conrad, der heute in Genf arbeitet, aufgezeigt werden.
Während eines Aufenthalts in Pittsburgh, USA, hatte Conrad in zwei Fällen von insulin-abhängigem Diabetes mellitus (Zuckerkrankheit) in den Inseln der Bauchspeicheldrüse, die mit Zellen des Immunsystems durchsetzt waren, eine Superantigen-Aktivität entdeckt. Superantigene sind Eiweisse und werden meistens durch Mikroorganismen gebildet. Er spekulierte, dass dieses Superantigen für das Auftreten der Krankheit verantwortlich war und durch Retroviren kodiert wurde.
In Kulturen, die er von diesen Inseln angelegt hatte, fanden wir eine geringe RT-Aktivität. Daraus konnten wir eine Sequenz gewinnen, die von einem menschlichen endogenen Retrovirus stammte. Wenn nun in gewissen Zellen des Immunsystems ein bestimmtes Gen von diesem Virus zur Expression gebracht wurde, entwickelten diese eine Superantigen-Aktivität mit den gleichen Eigenschaften, wie sie in den Inseln der zwei Zuckerkranken beobachtet worden war.
Ausgehend von diesen Befunden sind nun Experimente und Untersuchungen im Gang, die klären sollen, ob und wie dieses endogene Retrovirus in der Entstehung der Zuckerkrankheit eine Rolle spielt.
Dr. Jürg Böni ist Leiter der Molekularbiologischen Arbeitsgruppe und Dr. Jörg Schüpbach Titularprofessor für Virologie mit besonderer Berücksichtigung der Retroviren und Direktor des Nationalen Zentrums für Retroviren.
unipressedienst –
Pressestelle der Universität Zürich
Nicolas Jene (upd@zuv.unizh.ch)
Last update: 29.06.99
